Il Palazzo degli Uffizi fu ideato a partire dal 1559 e costruito in soli cinque anni (1560-65) dall'architetto Giorgio Vasari nel periodo in cui Cosimo de' Medici, primo granduca di Toscana, andava consolidando anche burocraticamente il suo recente dominio. A forma di ferro di cavallo, estesi da Piazza Signoria al fiume Arno, collegati con Palazzo Vecchio tramite il cavalcavia su via della Ninna e con Palazzo Pitti attraverso il Corridoio Vasariano (1565), gli Uffizi erano destinati a contenere gli "uffici" (da qui il nome) delle tredici magistrature da cui dipendeva l'amministrazione statale.

Negli ambienti del piano terreno trovarono invece posto i laboratori e le officine degli artisti e degli artigiani di corte, specializzati nelle lavorazione dei metalli, delle pietre dure, dei vetri, delle ceramiche e degli arazzi. Sul lato di ponente c'erano l'antica Zecca dove si coniavano i fiorini (incorporata nel Palazzo) e la Fonderia (o Farmacia) dove si distillavano profumi, medicine ritenute portentose e anche veleni. (Molte di queste attività sono state dipinte dagli allievi del Vasari sulle pareti dello Studiolo di Francesco I in Palazzo Vecchio).

Per far posto al suo edificio, Vasari abbattè le case del quartiere della "Baldracca" ma salvò, incorporandola nella costruzione, la chiesa di San Pier Scheraggio, sede dei consigli comunali della Repubblica fiorentina fino alla costruzione di Palazzo Vecchio (vi intervenne anche Dante). Si tratta di una basilica romanica (consacrata nel 1068) di cui un restauro del 1971 ha rimesso in luce i resti e le stratificazioni successive, fino a scoprire le vestigia di un ambiente affrescato della "Florentia" romana (forse una taverna) e quelle di una chiesa in stile longobardo. In questo spazio attiguo all'ingresso del museo, usato anche per conferenze, oggi sono conservati affreschi staccati di Botticelli (Annunciazione, 1481) e Andrea del Castagno (la serie degli Uomini illustri dalla villa Carducci a Legnaia, 1450 ca.).

La colossale costruzione degli Uffizi, che resta il massimo capolavoro del Vasari, è tutta giocata sul contrasto fra il bianco dell'intonaco e il grigio della pietra serena (come aveva insegnato Brunelleschi con l'Ospedale degli Innocenti) e sente molto l'influenza del Michelangelo della Biblioteca Laurenziana (cornici rilevate e forti modanature).
Snellezza e luce sono date all'edificio dalle molte decorazioni architettoniche: nel loggiato terreno colonne e pilastri, nel mezzanino piccole finestre quadrate inserite fra mensole, al primo piano solenni finestroni balconati, la loggia superiore col suo parapetto e le sue colonne, infine la grande sporgenza del tetto. All'interno del rettangolo si viene a creare una piazza (piazzale degli Uffizi) che è quasi un cortile.

Alla morte del Vasari (1574), lo sostituiscono gli architetti Alfonso Parigi e Bernardo Buontalenti, che entro il 1580 completano l'edificio unendolo, sul lato ovest, alla Loggia dei Lanzi, sopra la quale creano un giardino pensile e una loggetta distrutta nel 1840. Nel 1581 Buontalenti chiude per ordine di Francesco I la loggia superiore e la trasforma in Galleria da ornare con le collezioni artistiche granducali. Contemporaneamente i conti del pittore Alessandro Allori registrano le spese per le eleganti grottesche affrescate nella volta del primo corridoio della Galleria.

Buontalenti realizza ancora la Tribuna (1584) e il Teatro Mediceo (1586, demolito nel 1889), sede di storiche rappresentazioni, che si estendeva per l'altezza di due piani nei locali dell'attuale Gabinetto Disegni e Stampe: tre imponenti capriate lignee del suo soffitto sono state riportate alla luce nel 1978 e oggi ornano la Sala del Botticelli.

Nel Settecento, infine, i Lorena si occuperanno del nuovo (e ancora attuale) ingresso a levante, con i garbati scaloni e vestiboli di gusto quasi neoclassico, dipinti in rosa e verde pastello. L'architetto Gaspare Maria Paoletti realizza nel corridoio di ponente la splendida Sala della Niobe, degno pendant della Tribuna, per ospitare le dodici statue classiche giunte dalla Villa Medici di Roma. Soltanto al 1835, invece, risalgono le 28 statue di fiorentini illustri collocate nelle nicchie del portico esterno, che gira tutt'intorno alla piazza.