Gli Uffizi ospitano, su una superficie di circa 8.000 mq, una delle più importanti collezioni artistiche di tutti i tempi, comprendente sculture antiche e dipinti su tavola e tela di scuole italiane e straniere dal XIII al XVIII secolo. La Galleria degli Uffizi è stata anche il primo museo accessibile al pubblico: fin dal 1591 era visibile a chiunque ne facesse richiesta al Granduca. Con i suoi quattro secoli di storia, gli Uffizi sono da considerarsi il più antico museo del mondo.

Il Palazzo, iniziato da Giorgio Vasari nel 1560 e completato dal Buontalenti, che vi ideò la celebre Tribuna, fu concepito da Cosimo I de' Medici come sede degli uffici ("uffizi") amministrativi di Stato, per i quali Palazzo Vecchio, anch'esso affacciato su Piazza della Signoria, era diventato troppo piccolo. Ad iniziare la trasformazione in museo fu invece suo figlio Francesco I che, nel 1581, fece chiudere con grandi finestroni la Galleria del secondo piano e vi raccolse parte delle collezioni granducali di statue antiche, medaglie, gioielli, armi, quadri e strumenti scientifici.

Instancabili collezionisti, i Medici arricchirono costantemente la Galleria: tra gli ingressi più cospicui quelli dovuti all'eredità di Vittoria della Rovere (1631), moglie di Ferdinando II, e agli acquisti del cardinale Leopoldo de' Medici (1617-1675), grazie al quale furono gettate le basi del Gabinetto Disegni e Stampe (al primo piano degli Uffizi, dove un tempo sorgeva il Teatro di Corte costruito da Bernardo Buontalenti) e della raccolta di Autoritratti oggi esposti nel Corridoio Vasariano che unisce gli Uffizi alla reggia di Palazzo Pitti.

Alla morte dell'ultimo granduca Medici, Gian Gastone, la sorella Anna Maria Ludovica riuscì a impedire la dispersione del patrimonio artistico con il famoso "Patto di famiglia" (1737, riconfermato nel testamento del 1743) che lasciava tutto in eredità non ai successori della casa Asburgo-Lorena bensì alla città stessa di Firenze "per ornamento dello Stato, per utilità del pubblico e per attirare la curiosità dei forestieri". Questo documento risulterà fondamentale anche per ottenere la restituzione delle opere prelevate e trasportate a Parigi in epoca napoleonica.

Più volte ristrutturata e riordinata nei secoli secondo il gusto culturale delle varie epoche, la sede espositiva comprende oggi 45 sale con circa 1.700 dipinti, 300 sculture, 46 arazzi, 14 fra mobili e ceramiche. Le opere di proprietà degli Uffizi sono in realtà circa 4.800: le rimanenti si dividono fra i depositi e i prestiti ad altri musei.