Sotto il governo di Cosimo I, duca di Toscana dal 1537, Palazzo Vecchio muta completamente carattere pur mantenendo l'austero aspetto esteriore del palazzo di Arnolfo. Il Medici infatti sottolinea il cambiamento di rotta politica andando a vivere con tutta la famiglia nell'edificio che ospita da sempre il governo della città e incarica il suo architetto di fiducia, Giorgio Vasari, di adattarlo alla nuova situazione.

Fra il 1540 e il 1565, quando i Medici si trasferiranno nella reggia di Pitti, il Palazzo sarà più che raddoppiato grazie alla costruzione di un nuovo blocco sul lato posteriore, lasciando intatte le strutture che si affacciano sulla piazza. Nascono così, al secondo piano, il Quartiere degli Elementi, con lo splendido Loggiato di Saturno da cui si gode un panorama impagabile, e il Quartiere di Eleonora di Toledo, moglie del duca, ristrutturato e affrescato fra il 1559 e il '62. Qui, nella Camera Verde, si apre il collegamento con gli Uffizi. Infine (al primo piano) il Quartiere di Leone X, dedicato ai personaggi più illustri della famiglia Medici, riammodernato da Vasari nel 1555-62 su strutture già modificate da Giovan Battista di Marco del Tasso, direttore dei lavori in "Palazzo Ducale" (così viene detto in quegli anni) fra il 1550 e il '55 e autore della porta su via dei Leoni.

All'intervento vasariano si devono anche i due scaloni monumentali, il piccolo e sofisticato Studiolo di Francesco I, vero capolavoro del Manierismo fiorentino (1570- '75), e il complicato programma decorativo del Salone dei Cinquecento, tutto teso a celebrare il regno e le vittorie di Cosimo I. Sulla parete di fronte all'ingresso è anche la statua del Genio della Vittoria scolpita da Michelangelo nel 1506-34.
Fra le ultime realizzazioni ricordiamo la decorazione della Sala del Mappamondo, un tempo loggia e poi chiusa in occasione delle prime modifiche: qui i frati domenicani Ignazio Danti e Stefano Buonsignori dipingeranno fra il 1563 e l'84 una serie di 53 carte geografiche di grande interesse storico.