Al lavoro del Brunelleschi, proseguito dall'allievo Luca Fancelli dal 1458 e poi interrottosi nel 1472 con la morte del Pitti e il crollo delle ambizioni familiari, si sovrammisero le modifiche e gli ampliamenti di Bartolomeo Ammannati (1558-70), chiamato dai Medici a ristrutturare il Palazzo. L'Ammannati ridefinisce la facciata sostituendo i portali laterali con due finestre "inginocchiate" (modello inventato da Michelangelo), crea lo scalone che porta al primo piano e progetta per l'edificio due ali ortogonali per delimitare all'interno lo spazio del nuovo cortile. I tre piani che si affacciano sul cortile, vero capolavoro dell'Ammannati, sono separati dalla classica ripartizione in colonne doriche, ioniche e corinzie, ma il linguaggio é gia quello del Manierismo, le colonne-pilastro sembrano quasi tronchi d'albero nodosi e la contiguità col Giardino di Boboli asseconda e sottolinea la commistione fra arte e natura che la nuova cultura sottintende e che si sta sviluppando parallelamente anche nel parco. Il cortile, chiuso verso Boboli dalla Grotta di Mosé e dalla soprastante terrazza con la Fontana del Carciofo (1641, Francesco Susini), avrà un ruolo fondamentale nelle feste e nelle cerimonie di corte, specie in occasione delle nozze di Ferdinando I con Cristina di Lorena (1589): sarà allora il palcoscenico di complessi spettacoli, e perfino di una battaglia navale realizzata allagando l'intero spazio.

Una lunetta affrescata da Giusto Utens nel 1599 ci fa vedere l'aspetto di Palazzo Pitti in quegli anni e sottolinea la sua ambiguità di costruzione a metà strada fra il palazzo cittadino e la residenza di campagna. Sotto i regni di Cosimo II (1590-1621) e Ferdinando II (1610-70) la facciata assume l'aspetto definitivo grazie agli ampliamenti degli architetti Giulio Parigi (dal 1620) e di suo figlio Alfonso (1640-50). Il primo porta da 7 a 13 il numero delle finestre sulla piazza, il secondo allunga l'intera facciata di altre 10 finestre (5 per parte) ma solo nei due piani inferiori. Il prospetto raggiunge così le dimensioni di 205 metri di lunghezza per 36 di altezza.

Nascono intanto gli Appartamenti estivi (piano terreno, a sinistra), affrescati da Giovanni da San Giovanni, Vannini, Furini e Cecco Bravo (1635-42), si possono vedere visitando il Museo degli Argenti); gli Appartamenti monumentali (primo piano, a destra) e il Quartiere di Pietro da Cortona (primo piano, a sinistra) dal nome del pittore autore degli affreschi (1637 e 1641-47). In queste ultime sale e in quelle del contiguo Quartiere del Volterrano (autore, a metà Seicento, di affreschi per lo più distrutti) é fra l'altro ospitata parte della Galleria Palatina. La morte di Gian Gastone, nel 1737, e l'arrivo dei nuovi granduchi della casata Asburgo-Lorena, determina la successiva fase costruttiva dell'edificio e la storia di Palazzo Pitti dopo i Medici.